Exercise in known to inhibit M1 macrophage (M1ф) differentiation, and increase in M2 macrophage (M2ф) and inhibition of M1ф in adipose tissue are known to reduce obesity. However, studies on the effects of exercise are very limited and it has not yet confirmed whether the polarization of M1ф/M2ф actually changes. Therefore, I tried to confirm the M1ф/M2ф polarization in the real change in single bout of exercise.
Male C57BL/6 mice were divided into four groups; normal diet (ND) control (n=7), ND exercise (n=7), high-fat diet (HFD) control (n=7), and HFD exercise (n=7) groups. All exercise mice ran on a treadmill at 15 m/min for 60 minutes for single bout. All animals were sacrificed two hours after single-bout of exercise and adipose tissue was isolated. Adipocytes were extracted from isolated adipose tissue and FACS was performed.
Single bout of exercise in high-fat diet induced obese mice did not actually increase M2ф polarization in adipose tissue. Rather, the expression of M1ф was significantly higher than that of the other groups. However, expression of M2ф-related genes (Arg1) was highest in HFD-EX compared to ND control and HFD control.
Despite the increase of M1ф due to obesity, the expression of M2ф-related gene Arg1 was found to be increased by exercise regardless of the high-fat diet. These results suggest for the first time that a single bout of exercise can independently affect the change in M1ф/M2ф phenotypic ratio regardless of obesity or high-fat diet.
전 세계의 11% 이상이 비만이며 이 수치는 급속이 증가하고 있다. 비만만으로는 문제가 되지 않지만 고지혈증[
약물치료나 수술적 요법을 제외한 비만 치료는 운동과 식이 조절을 통한 체지방의 감소를 목표로 한다. 최근에는 비만을 개선시키기 위하여 면역학적인 연구가 활성화되고 있다. 여러 연구에 따르면 비만은 만성 염증이 동반되며 면역 세포와 다른 세포에서 전신과 조직 특이적인 염증 반응에 커다란 영향을 미칠 수 있다고 보고되었다[
같은 맥락에서 M2 대식세포(M2ф), Th2 (T helper 2) CD4 (cluster of differentiation)+T 세포, Treg 세포, 호산구(eosinophil) 및 선천성 림프구(innate lymphoid) 세포는 적절한 운동에 의하여 증가할 수 있으며, 비정상적으로 증가된 M1ф, Th1, Th17 (T helper 17) 및 CTL을 정상수치로 낮추어 면역학적인 항상성을 유지시킬 수 있다[
비만의 개선을 위한 면역학적 접근의 핵심 논리를 입증하기 위하여 많은 연구가 이루어졌으며 지방조직에서 M1ф/M2ф 비율에 대한 연구는 장기간의 운동을 통해 mRNA 수준에서 M2ф의 발현이 증가함을 보여주었다[
지방조직에서 M1ф/M2ф 비율 변화와 관련된 여러 연구들은 면역학적인 접근의 핵심을 어느 정도 입증하였다. 장기간의 운동과 관련된 지방조직에서의 M1ф/M2ф 비율 변화 관련 연구에서는 다양한 분자생물학적인 기법 중 real-time PCR (qPCR) 결과로 도출된 mRNA 수준에서의 대식세포 관련 유전자의 발현 차이를 확인하였고, 이를 통해 M1ф에서 M2ф로의 표현형 변화가 일어날 수 있다고 제안하였다[
이와 같이 장기간의 운동과 일회성의 운동 모두 M1ф/Mф의 비율을 변화시켜 비만을 개선시킬 수 있는 가능성이 여러 연구에서 확인되었다. 그럼에도 불구하고 여러 연구자들은 M1ф/M2ф의 실질적인 분극 변화를 합리적인 방법으로 확인하지 않아 지방조직에서 대식세포 분화 관련 유전자들의 발현 차이가 실제로 M1ф/M2ф 분극에 변화를 가져왔는지는 여전히 확인된 바가 없다. 또한 Oliveira와 그의 동료 연구자들은 일련의 운동 및 면역관련 연구에서 연구 부정을 저질러 논문 게재가 철회되기도 하여 연구결과의 진실성이 의심되기도 한다[
따라서 일회성 운동과 장기간의 운동 모두 M1ф/M2ф의 변화를 가져올 수 있다는 기존의 연구결과를 재검증하고 운동에 의한 지방조직에서의 실질적인 M1ф/M2ф 분극 변화를 확인하고자 하기 위한 추가적인 연구가 필요하다. 또한 합리적인 M1ф/M2ф 비율을 산정하기 위해서는 TNF-α, MCP-1 그리고 TLR4와 같이 지방세포와 대식세포에서 모두 발현되는 면역학적 매개변수(parameter)를 제외하여야 한다. 이를 위해서는 지방조직에서 지방세포를 분리하고 대식세포에서만 발현되는 F4/80을 인지하여 살아있는 세포에서 측정되어야 한다. 이전의 연구들은 이전의 장기간 운동관련 연구에서도 이러한 연구의 제한점을 정확하게 인지하고 있었다[
궁극적으로 일회성 운동과 장기간의 운동에 대한 효과를 모두 검증해야 하지만 본 연구자는 장기간의 운동을 통한 변화를 확인하기 이전에 급성면역반응과 대식세포의 변화를 확인하는 것이 우선적이라고 생각하였다. 그리고 비만과 인슐린 내성과 관련된 전 염증 상태와 관련하여 비만에서의 지방은 WAT로 축적되는 것이 알려져 있고, WAT에서의 대식세포의 침윤(infiltration)이 비만 관련 인슐린 저항성 발달에 필수적인 것으로 알려져 있다[
따라서 본 연구자는 세포를 특성에 따라 분류하기 위하여 FACS를 사용하였으며, 일회성 운동을 실시한 후 부고환 지방조직에서 지방세포를 분리하여 그 중 살아있는 전체의 대식세포를 동정하고 M1ф와 M2ф를 각각 형광표지하여 M1ф/M2ф의 표현형 차이에 따라 분류하여 대식세포의 분극이 실제로 어떻게 변화하는지 확인하고자 하였다.
6주령의 수컷 C57Bl/6 종 마우스 28마리를 분양받아 10주간 사육되었다. 실험기간 동안 실험동물 중 14마리는 일반식이를 섭취하였으며 나머지 14마리는 고지방식이를 섭취하여 비만이 유도되었다. 10주간의 사육이 끝난 후 일반식이를 섭취한 실험동물 중 7마리와 고지방식이를 섭취한 실험동물 중 7마리를 각각 무작위 선별하여 실험 종료일에 일회성 운동을 실시하였다. 따라서 최종 집단 구성은 일반식이군(normal diet control, ND control; n=7), 운동군(ND exercise, ND-EX; n=7), 고지방식이군(high-fat diet control, HFD control; n=7) 그리고 고지방운동군(HFD exercise, HFD-EX; n=7)으로 이루어졌다(
모든 일회성 운동 집단은 동물용 트레드밀(DJ-344; Daejong Instrument Industry, Daejeon, Korea)에서 운동을 수행하였다. 마우스의 운동 강도는 명확한 기준이 있지는 않으나 대체로 12-20 m/min의 속도로 30분에서 1시간가량 수행된다. 특히 실험에 사용된 C57BL/6 마우스는 젖산 역치를 통한 임계속도 추정 연구에서 약 18.7 m/min의 임계속도를 가지는 것으로 알려졌다[
연구목적에 따라 일회성 운동에 대한 운동과 식이의 영향을 모두 포함하기 위하여 10시간 이상의 장시간 절식은 실시하지 않았다. 장시간의 절식 또한 대식세포의 변화에 영향을 미친다고 알려져 있으며, 음식 섭취 후 인슐린의 작용에 의해 대식세포 관련 유전자 발현이 영향을 받을 수 있다[
체중변화뿐만 아니라 비만으로 인한 대사적 이상이 발생하였는지 확인하기 위하여 OGTT를 실시하였다. OGTT는 실험종료 2주일 전에 실시하여 OGTT에 실시되는 절식과 꼬리정맥의 미세한 상처에 대한 영향을 피하고자 하였다. 17시간의 절식 후에 OGTT가 실시되었다. 절식 시작 전 깨끗한 케이지로 실험동물을 옮긴 후 식이공급을 중단하여 깔집이나 사료 부스러기 등에 의한 공복 혈당의 개입요소들을 완벽히 차단하였다. 음수는 정상적으로 공급하였다. 꼬리정맥을 면도날로 약하게 베어내 혈액을 채취하고 공복 시 혈당을 측정하였다. 이후 20%의 포도당 수용액을 곡선 위관(curved gavage needle) 삽입을 통하여 경구투여하였으며, 투여량은 17시간 절식 후 측정된 공복시 체중에 근거하여 설정되었다 (공복시 체중 [g]×10 =20% 포도당 수용액 투여량[μL]). 포도당 수용액의 경구투여 후 꼬리정맥을 가볍게 압박하여 맺힌 혈액을 각 15분, 30분, 1시간 그리고 2시간 후 측정지에 점적하여 측정되었다. 모든 혈액은 ACCU-CHEKⓇ active (Roche Diabetes Care GmbH, Mannheim, Germany) 혈당측정기를 이용하여 측정되었다. OGTT 중 포도당 제거율을 평가하기 위하여 시간 경과에 따른 혈당치를 측정하여 꺾은선 그래프로 나타내어 곡선하면적(area under the curve, AUC)을 삼각함수법(trigonometric function)으로 계산하였다[
지방조직의 살아있는 세포에서 M1ф/M2ф의 분극을 확인하기 위해 희생 즉시 지방조직을 적출하여 수행되었다. 실험동물의 지방조직을 생리식염수로 세척한 뒤 잘게 자르고 2%의 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)과 클로스트리듐속(
TissueLyser LT (Qiagen, Hilden, Germany) 균질기를 이용하여 1.5 mL의 분쇄용 튜브에 지방조직과 함께 50-mm의 쇠구슬과 TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 시약을 넣고 50 Hz에 5분간 분쇄하여 균질화시킨 후 RNA를 추출하였다. cDNA는 M-MMLV RT (Promega, Madison, WI, USA) 반응 시약으로 합성되었다. 합성된 cDNA로 대식세포 분화와 관련된 유전자 발현을 분석하기 위하여 선정된 유도형 NO 생성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS), 종양괴사 인자-α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α), 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6), 세포간부착분자(intercellular adhesion molecule, ICAM-1) 그리고 알기나제-1 (arginase-1, Arg1)을 분석하였다. 96 well-plate에 cDNA와 각 유전자별 프라이머 그리고 AMPIGENEⓇ qPCR Green Mix Lo-Rox (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, USA)가 혼합된 샘플을 삼중(triplicated) 분주하였다. 샘플들 사이의 mRNA 수준을 표준화하기 위하여 glyceraldehyde 3-phaphate dehydrogenase (GAPDH)가 항존 유전자로서 함께 증폭되었다. LightCyclerⓇ 96 real-time PCR system (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)을 사용하여 증폭 및 분석되었다. 실험에 사용된 각 유전자별 프라이머 서열은
통계분석은 SPSS software version 23 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 수행되었다. FACS 결과는 집단 내 차이를 알기 위하여 독립표본
10주간의 고지방식이 섭취를 통해 일반식이를 섭취한 집단과 고지방식이를 섭취한 집단 사이의 신체적 특성과 식이경향을 비교하였다(
모든 개체의 혈당 측정 시간별 결과치를 평균 비교하고 그래프로 나타내고 경향을 나타내었다(
모든 M1ф와 M2ф 각각의 특이적 표지자인 CD11c와 CD206이 지방조직에서 추출된 모든 대식세포의 표지자인 F4/80으로 표지된 세포에 이중표지 되었고, FlowJo software로 분석된 분류결과 사진을 나타내었다(
염증세포의 부착과 이동에 관여하는 염증성 단백질인 ICAM-1의 발현은 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 활성화를 자극하고 T 세포의 활성화에 관여한다. 따라서 ICAM-1의 발현에 의해 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6가 자극된다. 따라서 우리는 ICAM-1과 TNF-α 그리고 IL-6를 분석하였고, 체내 증식된 대식세포에 의해 과발현되는 iNOS를 측정하여 M1ф의 관련 유전자 발현이 어떻게 변화하는지 확인하였다(
비만유도 기간 동안의 고지방식이 섭취는 높은 식이효율에 의해 과도한 체중의 증가를 초래하였다(
실험동물의 지방조직을 등장액인 HEPES buffer를 이용하여 살아있는 상태의 지방세포를 추출하였고 FACS를 이용하여 지방세포들 중 대식세포와 그 유형을 분류하였다(
본 연구에서 사용된 FACS 결과로 M1ф/M2ф의 분극 비율 변화가 논의되는 것은 IHC나 qPCR 같은 실험법에 비해 직접적이고 정량적이며, 살아있는 세포를 이용하였기 때문에 신뢰도와 타당도가 훨씬 높다고 할 수 있다. 그러므로 정상 마우스에서 일회성 운동에 의해 증가하는 M2ф의 실제적인 변화는 확실히 증명되었다고 보아도 무방하다. 이러한 사실은 일회성 운동은 급성적으로 염증반응을 높이지만 장기간의 운동과 마찬가지로 항염증작용을 하는 사이토카인이나 이동성 단백질들의 발현을 정상적으로 조절함으로써 면역체계의 균형을 유지한다는 것을 말해준다. 또한 이전 연구결과들과 마찬가지로 비만은 M1ф를 증가시키고 이로 인한 비정상적인 면역반응으로 전신의 염증반응이 유발되고 있음을 시사하고 있다[
그러나 본 연구자는 마지막 가능성으로 제안하고 싶은 것이 있다. 유의차는 없었으나 오히려 HFD-EX에서 M1ф 비율이 더 높았고 표준편차는 더욱 적었다는 사실은 조금 역설적으로 보인다. 따라서 본 연구에서 유발된 비만 마우스의 비만으로 인해 높은 유리지방산과 증가된 인슐린 저항성으로 인한 포도당 대체적인 지방산의 이용 증가와 관련이 있지 않을까 조심스럽게 제안해본다. 인슐린 저항성의 증가로 인한 혈당 조절 장애에 의해 세포에서 포도당 이용능력은 저하되고 지방산의 산화가 일반적으로 증가한다. 이러한 지방산 산화의 증가는 대식세포의 발현 증가를 야기할 수 있고 운동을 통하여 증가된 지방산 산화가 동시에 작용함으로써 상승작용을 일으켰을 수 있다는 가능성을 제기할 수 있다. 왜냐하면 본 연구에서 ND control에 의해 증가된 TNF-α와 IL-6는 이전 연구와 같이 지방조직에서 지방의 분해를 자극하여 인슐린 저항성을 유도한 것으로 보여지며[
결과를 직접적으로 해석하자면 고지방식이가 주어졌음에도 불구하고 ND control과 HFD control에 비해 유의하게 높게 발현되었고, ND-EX와 유의한 차이가 없으므로 같은 수준으로 유지되는 것으로 나타났다. 따라서 일회성 운동에 의해 M1ф에서 M2ф의 표현형 변화가 mRNA 수준에서 독립적으로 일어나고 있으나, 오랜기간 지속된 고지방식이에 의하여 M1ф 관련 유전자(ICAM-1, TNF-α, IL-4 및 iNOS)의 발현이 동시에 높게 일어나고 이러한 유전자 발현의 개입에 의해 실질적인 대식세포의 비율 변화에 영향을 미치지 못하였다. 하지만 M2ф 관련 유전자인 Arg1의 발현이 HFD control에 비해 HFD-EX에서 크게 증가함을 보여주어 지속적인 운동이 장기간의 M2ф 관련 유전자 발현을 자극하여 실제로 대식세포의 분극 비율 차이에 영향을 미칠 수 있다는 가능성을 보여주었다. 또한 이전의 일회성 운동연구에서는 정상식이와 함께 운동을 실시한 그룹이 없어서 평가가 불가능했으나 본 연구에서 M2ф의 발현이 ND-EX에 비해 ND control과 HFD control 모두 유의하게 발현이 낮았고, HFD-EX와는 차이가 없었다는 사실은 식이와는 무관하게 운동이 단독적으로 M2ф 관련 유전자의 발현의 증가시킨다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 일회성의 운동만으로는 유전자 발현 조절에 의해 실제적인 M1ф/M2ф분극에 의한 표현형 비율 차이를 유도하지 못하였다는 결과와 함께 이번 연구에서 새롭게 발견한 주요 결과이다.
일회성 운동은 대식세포의 실제적인 분극 차이를 가져오지 못하나 M2ф 관련 유전자의 발현을 증가시킨다. 또한 운동이 비만이나 식이에 관계없이 독립적으로 M2ф 관련 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 본 연구에서 새롭게 확인하였다.
Experimental design.
Body weight change during obesity induction phase. Data are presented mean±SD. ***
Changes in control ability of blood glucose concentration after obesity induction phase. Data are presented mean±SD. (A) Time-dependent changes in blood glucose during OGTT. (B) Calculated AUC by blood glucose concentration during the entire OGTT. (C) Calculated AUC by blood glucose concentration up to 30 minutes after start OGTT. (C, D) Calculated AUC by blood glucose concentration between 60 and 120 minutes after start OGTT *
Changes in M1ф and M2ф subpopulations with single bout of exercise and obesity. Data are presented mean±SD of seven mice per group. Representative FACS plots F4/80+cells gated on macrophages. (A) After single bout of exercise and CD11c+ and CD206+subpopulations gated on F4/80+cells. (B, C) Difference in M1ф/M2ф ratio evaluated by statistical analysis. (D) M2ф polarization evaluation with M2ф-M1ф (**
Expression differences of macrophage-related genes in isolated adipocytes from adipose tissue. Data are presented mean±SD of seven mice per group. (A) M1ф-related genes. (B) M2ф-related genes (*
Primer sequences of target genes for qPCR analysis
Gene | Forward primer (5’→3’) | Reverse primer (5’→3’) |
---|---|---|
GAPDH | TGAAGCAGGCATCTGAGGG | CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG |
Arg1 | GGGGAAAGCCAATGAAG | TGGTTGTCATCAGGGGAGTGT |
iNOS | CCTCCTCCACCCTACCAAGT | CACCCAAAGTGCTTCAGTCA |
TNF-α | CCTCCCTCTCATCAGTTCTA | ACTTGGTGGTTTGCTACGAC |
IL-6 | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC |
ICAM-1 | CCTGATGGGCAGTCAACAGCTA | ACAGCTGGCTCCCGTTTCA |
Information on weight change, food intake, and efficiency in the different groups during obesity induction phase
Total C57BL/6 mice (n=28) |
|||||
---|---|---|---|---|---|
Normal diet |
High-fat diet |
||||
ND control (n=7) | ND-EX (n=7) | HFD control (n=7) | HFD-EX (n=7) | ||
Initial weight (g) | 21.3 ± 0.71 | 21.4 ± 0.76 | 21.4 ± 0.66 | 21.6 ± 0.90 | |
Final weight (g) | 28.6 ± 1.49 | 29.9 ± 3.30 | 47.4 ± 2.77 | 48.9 ± 3.73 | < .00 |
Total weight gain (g) | 6.7 ± 1.38 | 7.5 ± 2.97 | 26.1 ± 2.11 | 27.3 ± 3.50 | < .00 |
Average weight gain (g/week) | 0.67 ± 0.13 | 0.75 ± 0.38 | 2.6 ± 0. 40 | 2.7 ± 0.62 | < .00 |
Food intake (g/week) | 22.4 ± 1.62 | 21.9 ± 1.07 | 17.5 ± 3.12 | 18.1 ± 3.73 | > .00 |
FER |
0.04 ± 0.01 | 0.04 ± 0.01 | 0.18 ± 0.04 | 0.19 ± 0.04 | < .00 |
Values are the mean±standard deviation.
Normal diet fed;
high-fat diet fed;
food efficiency ratio was calculated as body weight gain (g/week)/food intake (g/week).
> normal diet was significantly higher than high-fat diet; < high-fat diet was significantly higher than normal diet.